Existen estas enzimas llamadas enzimas de restricción , que reconocen el ADN de secuencias específicas llamadas sitios de reconocimiento y bases cortadas de regiones de ADN llamadas sitios de restricción . Los sitios de restricción / reconocimiento son altamente específicos, e incluso si solo hay una base diferente a su sitio de reconocimiento / restricción, la enzima de restricción no cortará el plásmido. Para evitar que los extremos cortados se ligen entre sí, se aplican las enzimas llamadas fosfatasas alcalinas .
Entonces, el ADNc o ADN genómico (creo que se elegiría dependiendo del experimento, si queremos que la bacteria exprese la proteína, es decir, que produzca químicamente una proteína funcional, usemos ADNc) se corta con la misma restricción enzima para hacer que los extremos cortados se unan mutuamente. Luego amplificamos estas partes de ADN con la reacción en cadena de la polimerasa .
Siguiendo este procedimiento, ligamos nuestro fragmento de ADN con plásmido cortado usando enzimas ligasa . La construcción final que tenemos, que contiene nuestro gen de interés y plásmido se llama plásmido recombinante .
Después de eso, producimos células bacterianas competentes , estas son células que pueden recoger plásmidos fácilmente. Las células bacterianas competentes pueden prepararse con métodos tales como:
- Electroporación : básicamente, los pulsos eléctricos se aplican a las bacterias y los poros se forman en sus membranas.
- Métodos químicos: los productos químicos se aplican a las bacterias con el mismo propósito.
Entonces, se fabrican plásmidos recombinantes y las bacterias los toman. El proceso en el que las bacterias toman plásmidos (o ADN extraño) se llama transformación.
Algunas bacterias toman plásmidos y otras no. Pero queremos colonias de bacterias “puras”, es decir, todos los miembros de la colonia deben contener nuestros plásmidos. Hacemos esto al matar todas las bacterias que no contienen ninguno de nuestros plásmidos. ¿Cómo matamos esas bacterias?
¿Pueden las bacterias rizobios vivir sin una planta de legumbres?
¿Cuáles son las características de las bacterias transgénicas?
Los plásmidos pueden tener un gen de resistencia a los antibióticos , un gen con un producto que da resistencia bacteriana a un antibiótico. Entonces, las células que toman los plásmidos sobreviven debido a este gen y el resto que no tomó ningún plásmido muere porque no tienen este gen de resistencia a los antibióticos.
Así que, básicamente, así es como manipulamos los plásmidos y se los damos a las bacterias. No sé sobre otras células bacterianas, pero creo que el protocolo sería más o menos el mismo. La bacteria que se usa con mayor frecuencia en las técnicas de biología molecular es E. coli .
Tengo mis referencias:
Células competentes para la transformación
Enzimas utilizadas en la clonación
