¿Cómo pueden identificarse las bacterias utilizando métodos moleculares?

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La ‘identificación’ se puede hacer de dos maneras: detección y escritura . La detección (por ejemplo, mediante ensayos de PCR) confirma la presencia de una cepa sospechosa. Escribir está haciendo un trabajo de detective para aprender la especie / cepa de las bacterias.

Esta es una lista de métodos moleculares que se elucidan más adelante. Ciertamente no es exhaustivo:

1. Ensayos basados ​​en PCR (detección)
   1. Reacción en cadena de polimerasa individual
   2. Reacción en cadena de la polimerasa múltiplex
   3. Otros ensayos de PCR
2. Electroforesis en gel de campo de pulso (mecanografía)
3. Mecanografía de secuencia de Multilocus (Mecanografía)
4. Ácido desoxirribonucleico polimórfico amplificado aleatorio (tipificación)
5. Análisis de perfil de plásmidos (mecanografía)
6. Secuenciación de ADN (mecanografía)

Ensayos basados ​​en PCR

Una visión general:

La reacción en cadena de la polimerasa es un proceso de amplificación in situ que realiza múltiples copias de una secuencia de ADN requerida basándose en los cebadores de oligonucleótidos proporcionados. Los ensayos de PCR son especialmente preferidos cuando se identifican bacterias que no se pueden cultivar de forma viable en el laboratorio, o cuando se identifican colonias que son morfológicamente muy similares.

También hay desventajas. En ciertos alimentos, los ensayos de PCR no pueden diferenciar entre células bacterianas viables y no viables. Además, se necesita una configuración experimental delicada y estable para llevar a cabo con éxito cualquier PCR.

Enumerados están las diferentes formas son ensayos de PCR:

1. Reacción en cadena de polimerasa individual

Se utiliza un solo conjunto de cebadores para dirigirse a un gen específico (comúnmente el gen rRNA 16s). Los cebadores pueden estructurarse para buscar solo una cepa específica, lo que permite la detección rápida de una especie en particular. Sin embargo, sin enriquecimiento de ADN, es común que este método detecte la presencia de genes en células muertas, dando falsos positivos.

2. Reacción en cadena de la polimerasa múltiplex

Se usan múltiples conjuntos de cebadores dentro del mismo medio de reacción para identificar y caracterizar múltiples especies bacterianas. Cada conjunto de cebadores se dirige a un gen único, que tiene una longitud distintivamente única. Al buscar longitudes específicas de oligonucleótidos una vez que concluye la reacción, se puede confirmar la presencia de bacterias específicas.

Este método permite la detección rápida de múltiples manchas de la misma reacción, ahorrando tiempo y recursos. Pero los cebadores deben diseñarse cuidadosamente para que compartan una temperatura de recocido más o menos similar y no interactúen innecesariamente entre sí para formar dímeros de cebador /

3. Otros ensayos de PCR

PCR en tiempo real : los colorantes de fluorescencia y las sondas se usan para cuantificar el producto de PCR incluso cuando se produce la PCR. Este método proporciona no solo la identificación de bacterias, sino también una estimación del número total.

PCR de transcripción inversa : muy útil para detectar únicamente células bacterianas viables / vivas. El ARN se transcribe de forma inversa a ADN y se amplifica. Sin embargo, administrar ARN es un dolor en el a **.

Mecanografía métodos: una visión general

Electroforesis en gel de campo de pulso
Esta es una forma de electroforesis en gel de agarosa con diferentes tamaños de ADN separados por campos eléctricos que cambian en tres direcciones diferentes. Inicialmente, los cromosomas se digieren usando endonucleasas para generar secuencias de ADN de diferentes tamaños. La aplicación del campo eléctrico dinámico crea un patrón que es único para cada especie bacteriana.

Mecanografía de Secuencias Multilocus
MLST es una técnica basada en nucleótidos para tipar bacterias utilizando las secuencias de fragmentos internos de (generalmente) siete genes de mantenimiento de la casa. En MLST, las diferentes secuencias dentro de una especie de bacteria se asignan como alelos distintos para cada gen de mantenimiento y los alelos en cada extremo de los siete loci definen el perfil alélico o el tipo de secuencia para cada aislado.

Se utilizan fragmentos internos de aproximadamente 450-500 pb de cada gen y la mayoría de las bacterias tienen suficiente variación dentro de los genes de mantenimiento para proporcionar muchos alelos por locus, permitiendo así que se diferencien miles de millones de perfiles alélicos diferentes utilizando los siete loci de mantenimiento de la casa

ADN polimórfico amplificado aleatorio
Esta es una técnica basada en PCR en la que se usan cebadores arbitrarios (típicamente cebadores de 10 meros) para amplificar aleatoriamente segmentos de ADN diana bajo condiciones de PCR de baja rigurosidad. Este proceso conduce a la amplificación de una o más secuencias de ADN y genera un conjunto de patrones de impresión de dedos de diferentes tamaños específicos para cada cepa.

Análisis de perfil de plásmido
El análisis del perfil del plásmido es una de las técnicas moleculares más antiguas utilizadas para la investigación epidemiológica.

En esta técnica, los ADN plasmídicos se extraen de las bacterias y el ADN se separa en electroforesis en gel de agarosa. Es fácil realizar esta técnica e interpretar los resultados, excepto que los plásmidos son elementos extracromosómicos móviles que pueden perderse espontáneamente o ser fácilmente adquiridos por bacterias y, por lo tanto, los aislados que están relacionados epidemiológicamente pueden mostrar fácilmente diferentes perfiles de plásmidos.

Además, los plásmidos tienen transposones que pueden contener determinantes resistentes que pueden perderse o adquirirse fácilmente, cambiando rápidamente la composición del ADN plasmídico.

Secuencia ADN
Las técnicas de secuenciación implican tecnologías utilizadas para determinar el orden de las bases de nucleótidos (a saber, adenina, citosina, guanina y timina) en una molécula de ADN. En los últimos tiempos, la secuenciación del ADN es ampliamente utilizada rutinariamente en la identificación, tipado, caracterización y / o clasificación taxonómica de aislados de patógenos nuevos o desconocidos por muchos investigadores. La secuenciación del ADN siempre ha estado precedida por la PCR para amplificar los genes diana. El rRNA 16S es un gen común que se amplifica para la secuenciación y posteriormente para la identificación, tipificación y / o clasificación taxonómica del patógeno en cuestión.

Adzitey, F., Huda, N., y Ali, GRR (2013). Técnicas moleculares para detectar y tipar bacterias, ventajas y aplicación a patógenos transmitidos por alimentos aislados de patos. 3 Biotech , 3 (2), 97-107. doi: 10.1007 / s13205-012-0074-4