Objetivos:
- Para diferenciar entre las dos categorías principales de bacterias: Gram positivas y Gram negativas.
- Comprender cómo la reacción de tinción de Gram afecta a las bacterias Gram positivas y Gram negativas en función de las diferencias bioquímicas y estructurales de sus paredes celulares.
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Principio:
La tinción es una técnica auxiliar utilizada en técnicas microscópicas que se utilizan para mejorar la claridad de la imagen microscópica. Las manchas y los colorantes son ampliamente utilizados en el campo científico para resaltar la estructura de las muestras biológicas, células, tejidos, etc.
El procedimiento de tinción más utilizado en microbiología es la tinción de Gram, descubierta por el científico y médico danés Hans Christian Joachim Gram en 1884. La tinción de Gram es una técnica de tinción diferencial que diferencia las bacterias en dos grupos: grampositivos y gramnegativos. El procedimiento se basa en la capacidad de los microorganismos para retener el color de las manchas utilizadas durante la reacción de tinción de Gram. Las bacterias Gram-negativas son decoloradas por el alcohol, perdiendo el color de la mancha primaria, púrpura. Las bacterias Gram-positivas no se decoloran con alcohol y se mantendrán como moradas. Después de la etapa de decoloración, se usa una contratinción para impartir un color rosa a los organismos gramnegativos decolorados.
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Importancia de una tinción de Gram:
La tinción de Gram es un paso preliminar muy importante en la caracterización inicial y clasificación de las bacterias. También es un procedimiento clave en la identificación de bacterias en función de las características de tinción, lo que permite que las bacterias se examinen con un microscopio óptico. Las bacterias presentes en un frotis sin teñir son invisibles cuando se observan con un microscopio óptico. Una vez teñido, también se puede observar la morfología y la disposición de la bacteria. Además, también es un paso importante en el cribado de agentes infecciosos en muestras clínicas, como los frotis directos de un paciente.
El procedimiento de tinción de Gram permite a las bacterias retener el color de las manchas, en función de las diferencias en las propiedades químicas y físicas de la pared celular.
1 . Bacterias gram positivas : se tiñen de color púrpura oscuro debido a que retienen el tinte primario llamado cristal violeta en la pared celular.
Ejemplo: Staphylococcus aureus
Fig: bacterias Gram positivas
2. Bacterias gramnegativas : se tiñen de rojo o rosa debido a que retienen el colorante de contraste llamado Safranin.
Ejemplo: Escherichia coli
Fig: bacterias Gram negativas
Morfología Bacteriana:
Las bacterias son microorganismos unicelulares muy pequeños de naturaleza ubicua. Son micrómetros (1μm = 10 ^ -6m) de tamaño. Tienen paredes celulares compuestas de peptidoglicano y se reproducen por fisión binaria. Las bacterias varían en sus características morfológicas.
Las morfologías más comunes son:
Coccus (pleural: Cocci):
Bacterias esféricas; puede ocurrir en parejas (diplococos), en grupos de cuatro (tetracocos), en racimos parecidos a uva ( estafilococos) , en cadenas ( estreptococos ) o en disposiciones cúbicas de ocho o más (sarcinae).
Por ejemplo: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes
Bacilo (pleural: Bacilos):
Bacteria en forma de vara; generalmente ocurren individualmente, pero ocasionalmente se pueden encontrar en pares (diplo-bacilos) o cadenas (estreptobacilos).
Por ejemplo: Bacillus cereus, Clostridium tetani
Spirillum (pleural: espirilla):
Bacterias en forma de espiral
Por ejemplo: Spirillum, Vibrio, Spirochete species.
Algunas bacterias tienen otras formas como:
Coccobacilos: Forma esférica u ovoide alargada.
Filamentoso: Bacilos que se producen en largas cadenas o hilos.
Fusiforme: Bacilos con extremos cónicos.
Fig: diferente morfología bacteriana
Mecanismo de tinción de Gram:
Pared celular positiva de Gram:
Las bacterias Gram-positivas tienen una pared celular similar a una malla gruesa que se compone de peptidoglicano (50-90% de la pared celular), que se tiñe de color púrpura. El peptidoglicano es principalmente un polisacárido compuesto por dos subunidades llamadas N-acetil glucosamina y ácido N-acetilmurámico. A medida que se forman capas adyacentes de peptidoglicano, se entrecruzan mediante cadenas cortas de péptidos por medio de una enzima transpeptidasa, dando como resultado la forma y la rigidez de la pared celular. La gruesa capa de peptidoglucano de organismos Gram-positivos permite que estos organismos retengan el complejo de cristal violeta-yodo y tiñe las células de púrpura.
El ácido lipoteicoico (LTA) es otro componente principal de la pared celular de bacterias Gram-positivas que está incrustado en la capa de peptidoglicano. Consiste en ácidos teicoicos que son cadenas largas de fosfato de ribitol ancladas a la bicapa lipídica a través de un glicérido. Actúa como regulador de las enzimas autolíticas de la pared (muramidasas: enzimas bacterianas localizadas en la pared celular que causan la desintegración de la célula luego de una lesión o la muerte).
Relevancia médica de la pared celular de Gram Positive:
LTA también tiene propiedades antigénicas que estimulan respuestas inmunes específicas cuando se libera de la pared celular después de la muerte celular. La muerte celular se debe a la lisis inducida por actividades lisozímicas, péptidos catiónicos de leucocitos o antibióticos beta-lactámicos.
Pared celular negativa de Gram:
Las bacterias Gram-negativas tienen una capa más delgada de peptidoglicano (10% de la pared celular) y pierden el complejo violeta-yodo cristalino durante la decoloración con el enjuague con alcohol, pero retienen el contraste de Safranina, apareciendo rojizo o rosado. También tienen una membrana externa adicional que contiene lípidos, que se separa de la pared celular por medio del espacio periplásmico.
Importancia médica de la pared celular de Gram Negativa:
La pared celular de las bacterias Gram negativas a menudo es un factor de virulencia que permite que las bacterias patógenas causen enfermedades. La virulencia de bacterias Gram negativas a menudo se asocia con ciertos componentes de la pared celular, en particular, el lipopolisacárido (también conocido como LPS o endotoxina). En humanos, el LPS provoca una respuesta inmune innata caracterizada por la producción de citoquinas y la activación del sistema inmune. La inflamación se produce como resultado de la producción de citoquinas, que también puede producir toxicidad en el huésped.
Reacción de manchas
Los cuatro pasos básicos de Gram Stain son:
1) Aplicación de la mancha primaria Crystal Violet (CV) a un frotis de cultivo bacteriano fijado al calor.
El CV se disocia en soluciones acuosas en los iones CV + y Cl -. Estos dos iones penetran a través de la pared celular y la membrana celular de las células Gram-positivas y Gram-negativas. Los iones CV + interactúan más tarde con componentes bacterianos con carga negativa y tiñen las células bacterianas de color púrpura.
2) Adición de yodo de Gram.
El yodo (I – o I3 -) actúa como un mordiente y como un agente de captura. Un mordiente es una sustancia que aumenta la afinidad de la pared celular por una mancha uniéndose a la mancha primaria, formando así un complejo insoluble que queda atrapado en la pared celular. En la reacción de tinción de Gram, el cristal violeta y el yodo forman un complejo insoluble (CV-I) que sirve para convertir el frotis en un color púrpura oscuro. En esta etapa, todas las células se volverán moradas.
3) Decoloración con 95% de alcohol etílico .
El alcohol o la acetona disuelven la membrana lipídica externa de las bacterias Gram negativas, dejando así la capa de peptidoglicano expuesta y aumenta la porosidad de la pared celular. El complejo CV-I se elimina por lavado de la capa delgada de peptidoglicano, dejando las bacterias Gram negativas incoloras.
Por otro lado, el alcohol tiene un efecto deshidratante sobre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas que hace que los poros de la pared celular se encojan. El complejo CV-I se une estrechamente a la pared celular Gram positiva altamente reticulada y de múltiples capas, manchando así las células de color púrpura.
El paso de decoloración debe realizarse con cuidado, de lo contrario puede producirse una decoloración excesiva. Este paso es crítico y debe sincronizarse correctamente; de lo contrario, la mancha de cristal violeta se eliminará de las células Gram-positivas. Si el agente decolorante se aplica en la célula durante demasiado tiempo, los organismos Gram-positivos aparecen como Gram-negativos. La falta de decoloración ocurre cuando el alcohol no se deja suficiente tiempo para eliminar el complejo CV-I de las células Gram-negativas, lo que hace que las bacterias Gram-negativas aparezcan como Gram-positivas.
4) Contratinción con Safranin
Las células Gram negativas decoloradas pueden volverse visibles con una contratinción adecuada, que generalmente es safranina con carga positiva, que las tiñe de rosa. El color rosado que se adhiere a las bacterias Gram positivas está enmascarado por el violeta de violeta cristal (a veces se usa fuschin básica en lugar de safranina en situaciones raras).
Fig: Cambios de color que ocurren en cada paso del proceso de tinción
