Esto no es exactamente lo que estás buscando, pero podrías introducir rupturas de ADN bicatenario, que en una bacteria haploide deberían ser reparadas mediante uniones no homólogas (NHEJ), un proceso que a menudo resulta en una variable. eliminación de longitud en el cruce. Podría utilizar radiación ionizante para inducir las interrupciones (o quizás una RAG recombinante a concentraciones suficientemente altas como para introducir roturas de forma específica).
Quiero cortar aleatoriamente una sección de aproximadamente 10 pares de bases del ADN en cada bacteria en un cultivo. ¿Cómo hago esto?
La respuesta dependerá de la bacteria con la que esté trabajando y cuán tratable sea genéticamente, es decir, qué tipo de herramientas tiene disponible.
Un enfoque común es usar un vector suicida que contenga un marcador seleccionable y un marcador contraseleccionable. En este vector, clonaría las regiones de ADN ascendentes y descendentes de sus 10 pb de interés, de una longitud suficiente para permitir la recombinación homóloga entre el plásmido y el genoma bacteriano (generalmente 1-2kb es suficiente, pero esto puede varían en función del sistema de recombinación homóloga en su organismo de interés).
A continuación, puede mover el plásmido a su bacteria, seleccionando su presencia, ya que es un vector suicida (no se puede replicar), esta selección fuerza la integración homóloga en su sitio diana en el cromosoma.
A continuación, puede utilizar la contraselección para forzar un segundo evento de recombinación, lo que provoca el retorno al estado natural o la eliminación (su evento deseado). Suponiendo que la eliminación de estos 10 pb no tiene un efecto perjudicial en su organismo, usted debería ver aproximadamente el 50% de cada uno, y deberá analizar mediante PCR, digestión de restricción u otro método similar, para identificar los candidatos que desea.
Este documento muestra un ejemplo de un experimento similar utilizado para generar una eliminación de genes en arqueas: manipulación genética de Methanosarcina spp. – ver figura 2 para el diagrama que muestra los eventos de recombinación. (El proceso funciona de manera similar en bacterias, aunque los detalles de los marcadores seleccionables y contraseleccionables son diferentes por supuesto).
Como dije, la respuesta a esta pregunta dependerá en gran medida del organismo con el que esté trabajando y de las herramientas que tenga disponibles, pero espero que esto brinde un punto de partida útil y le brinde algunas ideas.
La mejor solución es usar recombinación y una biblioteca de oligonucleótidos aleatorios en E. coli . Me sorprende que esto no haya sido mencionado. Consulte los métodos de inspiración TRMR (The Gill Lab) o MAGE (The Church Lab).
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