¿Qué pasará si utilizo un 8% de la capa superior de SDS-PAGE en lugar de usar el 4%? Mi capa inferior de la SDS-PAGE es del 12%. ¿Cómo va a afectar mi resultado?

Dado que está usando un gel de resolución al 12%, supongo que las proteínas que desea separar están en el rango de 15-70 kDa.

El concepto detrás del uso de un gel de porcentaje inferior para la capa superior o apilamiento es “apilar” todas las proteínas en la interfaz entre los dos geles para que las bandas en la capa inferior o de resolución . El bajo pH utilizado para la capa de apilamiento crea un gran gradiente de potencial a través de esta capa, de modo que todas las proteínas en sus pocillos pueden cruzar esta capa rápidamente y formar una banda nítida en la interfaz. Esto es particularmente útil cuando desea ejecutar grandes volúmenes de muestras de proteínas.

Idealmente, la diferencia en los porcentajes de gel entre sus dos capas no debería ser muy alta. Por ejemplo, para un gel de resolución del 6%, usaría una capa de apilado del 4%, para el 10% usaría el 6%, y así sucesivamente. Esto es para asegurar que las proteínas del rango de peso molecular deseado definitivamente se acumulen en la interfaz. Por lo general, se evita una gran diferencia en los porcentajes de gel (en mi opinión), ya que esto puede afectar la forma en que las proteínas deseadas se ejecutan en el gel.

Entonces, por ejemplo, si usara una capa apilable del 4% con un gel al 12%, esto podría dar como resultado que todas las proteínas se acumulen en la interfaz, incluidas las proteínas grandes> 150 kDa, y esto puede afectar inicialmente la carga de su proteínas más pequeñas de 15-70 kDa en el gel de resolución. Aunque estas proteínas grandes se retrasarán con bastante rapidez, una posible consecuencia menor es que es posible que no obtenga bandas finas crujientes para sus proteínas más pequeñas.

Por otro lado, si usa un gel de apilamiento del 8%, todas estas proteínas grandes se retrasarán en la capa de apilamiento, por lo que es posible que obtenga un rendimiento ligeramente mejor para sus proteínas más pequeñas. Personalmente, recomendaría un gel de apilamiento de 6-8% para un gel de resolución al 12%, pero al final, depende del tipo de resultados que desee.